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暗場(chǎng)顯微成像技術(shù)（DFM）和表面增強(qiáng)的拉曼光譜（SERS）和新興的分析技術(shù), 已廣泛應(yīng)用于化學(xué)檢測(cè)和生物傳感的快速診斷分析。近期，卓立漢光集團(tuán)拜訪合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院劉洪林教授課題組，課題組基于DFM和SERS這兩個(gè)關(guān)鍵技術(shù)在獼猴桃軟腐病致病菌屬鑒定方面開展了相關(guān)研究工作。

該研究成果以“Early warning of Diaporthe infection in kiwifruit soft rot by plasmonic dimer-enhanced Raman spectroscopy”為題發(fā)表在Iscience期刊中。

獼猴桃（Kiwifruit）富含充足的維生素C，具有抗氧化特性，受到廣泛關(guān)注。然而，其易受真菌病原體的侵害，在生長和儲(chǔ)存階段導(dǎo)致軟腐病，致使嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。擬莖點(diǎn)霉菌屬是一種常見的軟腐病致病菌屬。迄今為止，對(duì)這類致病菌的研究較少，亟需開發(fā)一種方便、快速、敏感的早期預(yù)警或診斷方法。

近日，研究團(tuán)隊(duì)篩選了一對(duì)致病菌屬水平的特異性引物，并基于此基礎(chǔ)開發(fā)了一種超靈敏的SERS檢測(cè)方法，用于早期獼猴桃中擬莖點(diǎn)霉菌屬的特異性檢測(cè)。采用RGBtoHSI算法輔助DFM成像實(shí)驗(yàn)調(diào)節(jié)引物修飾密度，促進(jìn)靶點(diǎn)誘導(dǎo)的金顆粒二聚化形成，在感染24h后即可實(shí)現(xiàn)陽性報(bào)告。與傳統(tǒng)PCR法相比，該新型SERS方法對(duì)擬莖點(diǎn)霉菌屬具有良好的特異性和超敏感性，為獼猴桃軟腐病病原菌感染的早期預(yù)警提供了良好的檢測(cè)技術(shù)手段。

圖1. 擬莖點(diǎn)霉菌屬的引物篩選

從NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得靶點(diǎn)目的基因核苷酸序列，通過DNAMAN比對(duì)確定擬莖點(diǎn)霉菌屬的保守區(qū)和可變區(qū)，用于引物設(shè)計(jì)。研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一條檢測(cè)引物(P1)；一條兼并引物(P2)。特異性引物可以從四株擬莖點(diǎn)霉菌屬中擴(kuò)增出一條清晰的條帶，而其他屬的12種真菌在相同條件下沒有擴(kuò)增，證實(shí)了引物的特異性。

圖2. 擬莖點(diǎn)霉菌屬引物協(xié)助金顆粒二聚化助力等離子體SERS和DFM信號(hào)的增強(qiáng)

P1和P2兩個(gè)引物探針可以與目標(biāo)物互補(bǔ)配對(duì)，錨定在金顆粒表面形成等離子體納米探針。利用P1和P2兩個(gè)引物探針縮短目標(biāo)片段的長度，目標(biāo)鏈在退火過程中與引物探針雜交形成Y型雙鏈，促使金顆粒二聚化，便于后續(xù)DFM成像和SERS檢測(cè)。

圖3. DFM表征金顆粒二聚化組裝過程

為了提高分類和定量分析的準(zhǔn)確性，研究團(tuán)隊(duì)首先利用DFM優(yōu)化了修飾在金顆粒表面引物探針的濃度，其原理主要是不同的等離子體納米探針聚集狀態(tài)在DFM下顯示出不同的顏色。由于局域表面等離子體共振耦合效應(yīng)，綠點(diǎn)和黃點(diǎn)代表金顆粒單個(gè)納米探針和金顆粒二聚體，橙點(diǎn)和紅點(diǎn)則是更大的成簇聚集體。研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)在引物探針比例合適的條件下，待檢目標(biāo)物誘導(dǎo)的聚集更傾向于金顆粒二聚體而不是大的成簇聚集體，即DFM觀察到的黃點(diǎn)較多，紅點(diǎn)較少。隨后采用RGBtoHSI算法對(duì)DFM成像納米探針的簇類型進(jìn)行區(qū)分和統(tǒng)計(jì)。根據(jù)分類的結(jié)果，用小矩形重新繪制斑點(diǎn)，繪制圖像與原始DFM圖像一致，說明了算法的可行性。

圖5. 植物病原菌基因組DNA的雙盲檢測(cè)

接下來，研究團(tuán)隊(duì)利用SERS探究金顆粒二聚體組裝過程。1326 cm−1波長處SERS信號(hào)的增強(qiáng)，表明隨著待測(cè)目標(biāo)濃度的增加，金顆粒二聚體增加，該結(jié)果與上述DFM成像的納米探針聚集狀態(tài)相匹配。提取獼猴桃軟腐病十八種已知病原體的基因組DNA進(jìn)行雙盲測(cè)試，檢測(cè)結(jié)果與預(yù)先標(biāo)記一致，表明SERS檢測(cè)在實(shí)際應(yīng)用中基因組DNA進(jìn)行分析的特異性和可行性。

圖6. 真正感染獼猴桃軟腐病的預(yù)警

最后，研究人員探究了SERS方法檢測(cè)病原體感染獼猴桃的適用性和敏感性。收集不同時(shí)間點(diǎn)的感染組織，提取基因組DNA，進(jìn)行SERS檢測(cè)。與PCR法相比較，感染24 h后，感染組產(chǎn)生的SERS信號(hào)明顯高于對(duì)照組。這些結(jié)果都表明SERS檢測(cè)法比PCR法更敏感，可以在沒有明顯癥狀的情況下診斷患病的獼猴桃，更適合用于獼猴桃軟腐病感染的早期預(yù)警。

獼猴桃軟腐病致病菌屬鑒定實(shí)驗(yàn)手冊(cè)流程圖

此外，研究團(tuán)隊(duì)還凝練了獼猴桃軟腐病致病菌屬鑒定實(shí)驗(yàn)手冊(cè)。該實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中詳細(xì)介紹了如何篩選擬莖點(diǎn)霉菌屬的保守區(qū)域，并設(shè)計(jì)合適的納米探針。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，例如基于病原體特征的表觀分析，病理檢測(cè)和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法，它們要么耗時(shí)長，要么靈敏度低，不適合實(shí)際的應(yīng)用。通過DFM對(duì)不同金顆粒聚集狀態(tài)進(jìn)行分類；利用SERS對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)具有方便、快速和靈敏度高的優(yōu)勢(shì)。首先，利用MEGA7篩選擬莖點(diǎn)霉菌屬的保守序列，設(shè)計(jì)引物互補(bǔ)序列構(gòu)建納米探針；隨后， 利用DFM技術(shù)分別對(duì)金顆粒的聚集狀態(tài)進(jìn)行分類和信號(hào)觀察。同時(shí)，利用Fiji-ImageJ 2軟件代碼轉(zhuǎn)換實(shí)現(xiàn)DFM圖像的批量處理。最后，利用便攜式拉曼光譜儀實(shí)現(xiàn)了對(duì)擬莖點(diǎn)霉菌屬不同種屬的快速檢測(cè)。

綜上所述，一方面，基于DFM技術(shù)研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種無“系繩”連接的單分子偶極與單個(gè)金顆粒之間的PRET納米尺模型，在活細(xì)胞受體蛋白分子水平上測(cè)量了位點(diǎn)間分離距離和蛋白質(zhì)互作。該新型納米尺具有抗自淬滅和光漂白的穩(wěn)定性，在觀察單分子事件方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，為納米尺度距離測(cè)量增添了新的替代工具，在未來食品與生物工程領(lǐng)域的生物標(biāo)志物檢測(cè)和靶標(biāo)鑒定方面具有重要的科學(xué)意義。另一方面，基于DFM和SRES技術(shù)，開發(fā)了一種等離子體二聚化SERS檢測(cè)方法，能夠在獼猴桃感染軟腐病的早期24小時(shí)內(nèi)檢出致病菌。通過DFM和RGBtoHSI算法輔助優(yōu)化了引物探針的比例，提高了SERS檢測(cè)的靈敏度。在獼猴桃病原體感染早期預(yù)警和現(xiàn)場(chǎng)管理決策方面具有較大的應(yīng)用前景。

合肥工業(yè)大學(xué)劉洪林課題組簡(jiǎn)介

劉洪林，博士，教授，博士生導(dǎo)師，黃山學(xué)者，國家優(yōu)秀青年科學(xué)基金獲得者，國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目首席科學(xué)家。入選合肥市高層次人才、安徽省級(jí)領(lǐng)軍人才。獲得中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)理學(xué)學(xué)士和工學(xué)博士學(xué)位。主要從事食品安全領(lǐng)域的化學(xué)與生物傳感分析、食品質(zhì)量安全評(píng)價(jià)與監(jiān)控技術(shù)研究。

已主持國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國家優(yōu)秀青年科學(xué)基金、省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃等項(xiàng)目10余項(xiàng)。已在Nature Commun.、J. Am. Chem. Soc.、Anal. Chem.、Food Chem.、LWT等雜志發(fā)表論文50余篇，入選全球Top 1%“ESI”高引論文，獲得安徽省自然科學(xué)論文一等獎(jiǎng)、安徽省自然科學(xué)獎(jiǎng)一等獎(jiǎng)等獎(jiǎng)勵(lì)。

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