引言

生物流體（如血液、尿液、唾液等）中細菌的存在與人類生活和公共健康密切相關。在疾病初期及時、準確鑒定致病菌種類對確認致病菌感染源和阻止疾病傳播至關重要。傳統(tǒng)細菌檢測方法有平板計數(shù)法、酶聯(lián)免疫吸附反應（ELISAs）、聚合酶鏈式反應法（PCRs）等，這些技術雖然促進了細菌檢測的發(fā)展，但仍存在耗時長、勞動密集、實驗成本高等不足。雙重酶級聯(lián)反應具備更低的活性位點，傳質(zhì)速度快、反應效率高等優(yōu)勢，近年來被越來越多的用于生物傳感檢測領域。

近期，南京師范大學王琛教授課題組采用一步還原法制備了雙重酶級聯(lián)反應Au@POM 納米顆粒子，實驗采用金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作為模型，以可見光波段光譜吸收強度為依據(jù)，分析細菌代謝過程中葡萄糖濃度與細菌代謝速度關系。實驗證明，Au@POM納米酶級聯(lián)催化反應在細菌含量為1-7.5 x 10⁷ CFU mL^-1呈線性關系，檢測限為5 CFU mL^-1。

結果分析

納米酶級聯(lián)催化的細菌檢測原理如圖1所示，采用一步還原法制備Au@POM 納米顆粒，金屬氧酸鹽（POMs）為殼、金納米粒子（AuNPs）為核。金納米顆粒（AuNPs）具備葡萄糖氧化酶（GOx）活性，金屬氧酸鹽（POMs）具備過氧化物酶（HRP）活性，制備的Au@POM 納米顆粒具備雙重酶活性。實驗時采用金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為模型，在細菌生長和繁殖過程中需要消耗葡萄糖能源，理論上葡萄糖含量越高，細菌含量越低，因此可將葡萄糖含量與細菌含量的線性關系作為細菌定量分析的可行性策略。首先，AuNPs的葡萄糖氧化酶活性將葡萄糖底物氧化為葡萄糖酸，并產(chǎn)生H₂O₂，然后，利用POMs的過氧化物酶活性，將3’,3’5’,5’-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）氧化為TMB⁺,形成強可見光吸收峰。

圖1納米酶級聯(lián)催化的細菌檢測原理示意圖。（A） 一步還原法制備Au@POM（B） 級聯(lián)催化Au@POM納米酶。（C） 細菌在代謝過程（D）細菌/無細菌生物體系中可見光吸收強度。

圖2 (A) Au@POM 納米顆粒TEM圖像，顆粒直徑15nm，Au核的POM薄層厚約1nm；（B）SEM圖和EDS圖譜；（C）納米顆粒ζ電位圖；（D）不同材料XRD圖；（E）Au與Au@POM的可見光吸收譜，介電常數(shù)改變導致Au@POM紅移

圖3 （A）不同體系可見光吸收光譜；（B）Au@POMs + Glu + TMB納米酶級聯(lián)催化體系可見光吸收譜峰與反應時間關系；（C）對葡萄糖濃度做Michaelis–Menten模型的穩(wěn)態(tài)動力學測定（TMB濃度為1.2mM）；（D）納米酶級聯(lián)反應的雙倒數(shù)圖

實驗時采用金黃色葡萄球菌作為模型，隨著細菌含量增加，吸收峰強度明顯降低，在濃度為10-1x10⁷ CFU mL^-1區(qū)間，細菌含量與吸收峰強度呈現(xiàn)良好的線性關系，金黃色葡萄球菌檢測限為5 CFU mL^-1。作者同步做大腸桿菌對比實驗，其吸光度強度隨細菌濃度變化趨勢與金黃色葡萄球菌相似，結果表明Au@POMs納米酶級聯(lián)催化反應具有良好的普適性。

圖4 （A）納米酶級聯(lián)反應細菌檢測原理示意圖；（B）不同尺寸金黃色葡萄球菌的暗場視野圖像（0,10,10²-10⁷ CFU·mL^-1）；（C）加入不同含量細菌后的可見光吸收光譜圖；（D）人體血清樣品和PBS緩沖液的細菌檢測

結論

本文采用一步還原法合成納米酶級聯(lián)反應Au@POMs納米顆粒，該體系制備的Au@POM 納米顆粒具備雙重酶活性，以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為模型，采用暗場顯微鏡直接觀測細菌形貌，并通過不同細菌模型的可見光吸收光譜進行細菌濃度的半定量分析。結果表明，細菌含量與可見光吸收強度具備良好的線性關系。將金黃色葡萄球菌摻入10%血清中，結果與在PBS緩沖液中結果相似，表明該方法在真實樣品檢測中具備潛在應用，為高靈敏度實施細菌檢測提供了有力工具。

南京師范大學王琛教授課題組簡介

王琛，南京師范大學化學與材料科學學院教授，博士生導師，國家優(yōu)秀青年科學基金獲得者（2020年），江蘇省“青藍工程"優(yōu)秀青年骨干教師、中青年學術帶頭人；南京師范大學本科、碩士，2011年博士畢業(yè)于南京大學化學化工學院生命分析國家重點實驗室，2012-2016南京大學從事物理學博士后，2016-2017年麻省理工學院（MIT，美國）訪問學者。至今，在Angew. Chem. Int. Ed., Sci. China Chem., Nano lett., ACS Nano, Anal. Chem.等學術期刊發(fā)表研究論文60 余篇；參編英文圖書 《Nanobiosensors: From Design to Applications》(Wiley)；主持多項國家自然科學基金、江蘇省重點研發(fā)、江蘇省自然科學基金等項目；擔任Chinese Chemical Letters期刊編委，中國分析測試協(xié)會青年學術委員會委員，江蘇省材料學會副秘書長。

文章信息

本文以“Nanozyme-catalyzed cascade reaction enables a highly sensitive detection of live bacteria"為題發(fā)表在Journal of Materials Chemistry B上，中國藥科大學柳文媛教授和南京師范大學王琛教授為通訊作者。

本研究暗場顯微圖像使用的是北京卓立漢光儀器有限公司RTS2 多功能激光共聚焦顯微拉曼光譜儀，如需了解該產(chǎn)品，歡迎咨詢。

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